犬冠状病毒探针法qRT-PCR试剂盒 Canine Corona Virus Probe qRT-PCR Kit

产品及特点

犬冠状病毒(canine coronavirus ， CCoV) 是单股正链RNA病毒 ， 是1种严重危害养犬业、 经济动物养殖业和野生动物保护的病毒性传染病病源 。可使犬发生程度不同的胃肠炎症状 ，特征有频繁呕吐 、 腹泻 、 沉郁 、 厌食等症状 。 本病一年四季均可发生 ， 以冬季多发 ， 病犬是主要的传染原 ， 犬可通过呼吸道 、 消化道 、 粪便及污染物传染 。 该病一但发生 ， 同窝犬同室犬很难控制均可造成感染 。 该病经常和犬细小病毒 ， 轮状病毒及其它胃肠道疾病混合感染 ， 幼犬死亡率较高 。 因此快速检测犬冠状病毒具有重要的意义 。 本产品就是以探针法qRT-PCR技术为基础开发的专门检测犬冠状病毒RNA的试剂盒 ， 它具有下列特点：

1.   即开即用 ，用户只需要提供样品 RNA 模板。

2.    引物和探针经过优化 ，灵敏性高 ，可以达到 100 拷贝/反应。

3.   提供阳性对照 ，便于区分假阴性样品。

4.   特异性高  ， 引物是根据犬冠状病毒RNA高度保守区设计 ，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。

5.    既用于定性检测 ，又用于定量检测 。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6.   本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 qRT-PCR 反应。

7.   本产品只能用于科研。

规格及成分

试剂盒组成

注意 ： 引物-探针干粉在使用前需要短暂离心 ，然后在离心管中加入165uL的超纯水充分混匀后再使用 ，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存

低温运输 ， -20℃保存 ，保存期限为24个月。

自备试剂

样品RNA

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以10E 1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例） 。

由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ， 千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分 。 为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ，本产品不提供活体样品做阳性对照 ，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管 ，分别为6 ， 5 ，4 ， 3 ，2 ， 1。

2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液 ，最好用带芯枪头 ， 下同。

3. 在6号管中加入5 μL 1 × 10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供) ，充分震荡1分钟 ，得1 × 10E6拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。

4. 换枪头 ，在5号管中加入5 μL 1 × 10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟 ，得1 × 10E 5拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。

5. 换枪头 ，在4号管中加入5 μL 1 × 10E 5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟 ，得1 × 10E4拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如 果 有 N 个 样 品  ， 最 好 设 置 N+2 个 提 取  ， 多 出 的 一 个 是 PC （样 品 制 备 阳 性 对照）  ， 一个是NC（样品制备阴性对照）  。 可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样 ， 以此作为PC 。另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的RNA  ， 本试剂盒跟市场上大多数样品RNA提取试剂盒兼容。

也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、 Probe qPCR反应（20μL体系 ，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复 ， 则标记N+9个RT-PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品  ， 1个用于RT-PCR阴性对照 （用水做模板）  ， 6个用于标准曲线 。 如果做定性分析并且只做1次重复 ， 则标记N+4个RT-PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板）  ， 1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）  。 下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.  在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复 。样品管和阴性对照设置完毕