流感嗜血杆菌B型探针法qPCR试剂盒（不含内参） Haemophilus influenzae B Probe qPCR Kit
Catalog No.：FK0010
产品及特点
流 感 嗜 血 杆 菌 （ Haemophilus influenzae） 是 一 种 没 有 运 动 力 的 革 兰 氏 阴 性 杆菌 , 是儿童鼻咽部常见的共生细菌 。 流感嗜血杆菌主要有6种菌株 ， 称为A型 、 B型、 C型、 D型、 E型及F型 。其中B型较为常见且危害较大 ， 它主要通过脑膜炎和肺炎感染 。每年估计造成约300万人严重患病 ， 并估计造成38.6万人死亡 。几乎所有患者都是5岁以下儿童 ，年龄为4至18个月的儿童尤为脆弱 ，给人类健康造成成了较大危害 。因此快速检测流感嗜血杆菌B型具有重要的意义 。 为此 ， 本公司以探针法qPCR技术为基础开发了流感嗜血杆菌B型的检测试剂盒 ， 它具有下列特点：
1. 即开即用 ，用户只需要提供样品DNA模板。
2. 引物和探针经过优化 ，分析灵敏度高 ，可以达到100拷贝/反应。
3. 提供阳性对照 ，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高 ， 引物是根据流感嗜血杆菌B型DNA高度保守区设计 ，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测 ，又可用于定量检测 。定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6. 本产品足够50次20μL体系的探针法qPCR反应。
7. 本产品只能用于科研。
规格及成分
试剂盒组成
成分规格包装2 × Probe qPCR MasterMix0.5 mL0.5 mL荧光PCR专用模板稀释液1mL1.5 mL超纯水1 mL1.5 mL流感嗜血杆菌B型qPCR引物-探针干粉50次0.5 mL流感嗜血杆菌B型qPCR阳性对照(1E 7拷贝/μL)50μL0.5 mL使用手册1份1份
注意 ： 引物-探针干粉在使用前需要短暂离心 ，然后在离心管中加入165uL的超纯水充分混匀后再使用 ，未用完的需要-20℃保存。
运输及保存
低温运输 ， -20℃保存 ，保存期限为24个月。
For Research Only
苏州丰度蛋白生物技术有限公司（www.fedprotein.com)
自备试剂
样品DNA ，超纯水 ，核酸纯化试剂盒。
使用方法
一、稀释标准曲线样品（以1E 1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例） 。
由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ， 千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分 。 为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ，本产品不提供活体样品做阳性对照 ，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管 ，分别为6 ， 5 ，4 ， 3 ，2 ， 1。
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液 ，最好用带芯枪头 ， 下同。
3. 在6号管中加入5μL 1 E7拷贝/μL的阳性对照（试剂盒提供） ，充分震荡1分钟 ，得1E6拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。
4. 换枪头 ， 在5号管中加入5μL 1 E6拷贝/μL的阳性对照（上步稀释所得） ， 充分震荡1分钟 ，得1E 5拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。
5. 换枪头 ，在4号管中加入5μL 1 E 5拷贝/μL的阳性对照（上步稀释所得） ，充分震荡1分钟 ，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
7. 如 果 有 N 个 样 品 ， 最 好 设 置 N+2 个 提 取 ， 多 出 的 一 个 是 PC （样 品 制 备 阳 性 对照） ， 一个是NC（样品制备阴性对照） 。 可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样 ， 以此作为PC 。另外用水作为NC。
8. 用自选方法纯化样品的DNA ，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容 。
也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、 Probe qPCR反应（20μL体系 ，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做1次重复 ， 则标记N+9个PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于PCR阴性对照 （用水做模板） ， 6个用于标准曲线 。 如果做定性分析并且只做1次重复 ， 则标记N+4个PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于PCR阴性对照 （用水做模板） ， 1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板） 。 下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复 。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照 ， 并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加） :
成分
样品管N+2个
PCR阴性对照
标准曲线样品管
（1-6管）
2 × Probe qPCR MasterMix
10 μL
10 μL
各10 μL
流感嗜血杆菌B型
qPCR引物-探针混合液
3 μL
3 μL
各3 μL
N+2个待测DNA样本
7 μL
不加
不加
超纯水
不加
7 μL
不加
第6步所得标准曲线样品稀释液
（1-6号）
不加
不加
各7μL（1号样到
1号管 ， 2号样到
2号管 …）
11. 盖上盖子后上机 ，按下面参数进行PCR：
过程温度时间预变性95 ℃10 min PCR反应 （40个循环）95 ℃15 sec60℃30 sec（采集FAM通道的荧光信号 ， 设置TAMRA为淬灭基团）
四、数据处理
12. 如果样本制备阳性对照或PCR阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性 ， 则整个实验无效 ，不需要分析数据 ， 需要重新样本制备 ，重新进行PCR扩增或跟厂家联系 。如果样本制备阴性对照或PCR阴性对照结果为阳性 ， 说明环境污染 , 则整个实验无效 ，不需要分析数据 ， 需要跟厂家联系 ，购买新的引物和探针。
13. 如果阴性对照和阳性对照均正常 ，则实验有效 ，可以进入后续分析。
14. 如果把本试剂盒用于定量检测 ， 则以阳性对照浓度的log值为横轴 ， 以Ct值为纵轴 ， 绘制标准曲线 。 再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值 ， 再推算出其浓度。
15. 如 果 把 本 试 剂 盒 用 于 定 性 检 测 ， 只 判 断 阳 性 或 阴 性 ， 则 阴 性 对 照 Ct 必 须 没 有 读数 ， 或者大于或等于40 。 阳性对照必须有荧光对数增长 ， 有典型扩增曲线 ， Ct值应该小于40 ，否则实验无效 。如果实验有效 ，则分析待测样品 ，如果无Ct或Ct大于或等于40 ，则为阴性 。如果Ct小于40则为阳性。
