沙眼衣原体探针法 qPCR 试剂盒（不含内参） Chlamydia trachomatis Probe qPCR Kit
Catalog No.：FK0007
产品及特点
沙眼衣原体 （Chlamydia trachomatis） 是一种原核细胞型微生物 ， 为圆形或椭圆形 ， 直径约 0.3 μm 。 沙眼衣原体生物变种有 A～ K 18 个血清型 ， 其中 A 、 B 、 Ba 、 C引起沙眼 ， D～ K 型引起泌尿生殖道感染 。 沙眼衣原体是通过性接触传播造成泌尿生殖道感染和性病淋巴肉芽肿的主要病原之一 ， 并且该微生物还会引起眼部病变 ， 出现眼部感染性疾病沙眼 ，也是感染致盲的主要因素 ，对人体健康产生极大危害 ， 因此快速检测沙眼衣原体具有重要意义 。本产品就是以探针法 qPCR 技术为基础开发的专门检测沙眼衣原体的试剂盒 ， 它有下列特点：
1. 即开即用 ，用户只需要提供样品DNA模板。
2. 引物和探针经过优化 ，分析灵敏性高 ，可以达到100拷贝/反应。
3. 提供阳性对照 ，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高 ， 引物是根据沙眼衣原体 DNA 高度保守区设计 ，不会跟其他生物的 DNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测 ，又可用于定量检测。定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。
6. 本产品足够50次20μL体系的探针法qPCR反应。
7. 本产品只能用于科研。
规格及成分
试剂盒组成
成分规格2 × Probe qPCR MasterMix0.5mL荧光 PCR 专用模板稀释液1mL超纯水1 mL沙眼衣原体qPCR 引物-探针干粉50次沙眼衣原体 qPCR阳性对照(1E 7 拷贝/μL)50μL
注意： 引物-探针干粉在使用前需要短暂离心 ，然后在离心管中加入165μL的超纯水充分混匀后再使用 ，未用完的需要-20℃保存。
运输及保存
低温运输 ， -20℃保存 ，保存期限为24个月。
自备试剂
样品DNA
For Research Only
苏州丰度蛋白生物技术有限公司（www.fedprotein.com)
使用方法
一、稀释标准曲线样品 （以 1 E 1 -1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例） 。 由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ， 千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。
1. 标记6个离心管 ，分别为 6 ， 5 ，4 ， 3 ，2 ， 1。
2. 用带芯枪头分别加入45μL 荧光PCR专用模板稀释液（最好用带芯枪头 ，下同） 。
3. 在6号管中加入5μL 1E7拷贝/μL的阳性对照（试剂盒提供） ，充分震荡1分钟 ，得1E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头 ，在5号管中加入5μL 1E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟，得1E5 拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头 ，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
7. 如果有N个样品 ，最好设置N+2个提取 ，多出的一个是PC（样品制备阳性对照） ，一个是NC（样品制备阴性对照） 。可以用10 μL 上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样 ，以此作为PC。另外用水作为NC。
8. 用自选方法纯化样品的DNA ，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、 Probe qPCR 反应（20μL体系 ，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做1次重复 ，则标记N+9个PCR管 ，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于PCR阴性对照（用水做模板） ， 6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复 ，则标记N+4 个PCR管 ，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于PCR阴性对照（用水做模板） ， 1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板） 。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照 ，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分
样品管N+2个
PCR
阴性对照
标准曲线样品管
（1-6管）
2 × Probe qPCR MasterMix
各10μL
10μL
各10μL
沙眼衣原体 qPCR引物-探针混合液
各3μL
3 μL
各3μL
N+2 个待测 DNA 样本
各7μL
-
-
超纯水
-
7 μL
-
第 6 步所得标准曲线样品稀释液
（1-6 号）
不加
不加
各7μL（2号样到2号管 ， 3号样到3号管 …）
11. 盖上盖子后上机 ，按下面参数进行 PCR：
过程温度时间预变性95℃10 min PCR 反应（40个循环）95℃15 sec 60℃30 sec（采集FAM通道的荧光信号 ，淬灭基团为MGB）四、数据处理
12. 如果样本制备阳性对照或 PCR 阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性 ，则整个实验无效 ，不需要分析数据 ，需要重新样本制备 ，重新进行 PCR 扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或 PCR 阴性对照结果为阳性 ，说明环境污染 ，则整个实验无效 ，不需要分析数据 ，需要跟厂家联系。
13. 如果阴性对照和阳性对照均正常 ，则实验有效 ，可以进入后续分析。
14. 如果把本试剂盒用于定量检测 ，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴 ，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测 ， 只判断阳性或阴性 ， 则阴性对照必须无 Ct 或 Ct 大于或等于 40 。 阳性对照必须有荧光对数增长 ， 有典型扩增曲线 ， Ct 值应该小于
40 ， 否则实验无效 。 如果实验有效 ， 则分析待测样品 ， 如果无 Ct 或 Ct 大于或等于 40 ，则为阴性 。如果 Ct 小于 40 则为阳性。
关联产品
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