庚型肝炎病毒探针法qRT-PCR试剂盒Hepatitis G Virus Probe qRT-PCR Kit

产品及特点

庚型肝炎病毒 （ Hepatitis G Virus, HGV)属于黄病毒科 ， 为单正链RNA病毒 。 基因组仅有一个ORF ， 编码一个长约2900个氨基酸的前体蛋白 ， 经病毒和宿主细胞蛋白酶水解后 ，形成不同的结构蛋白和非结构蛋白 。 主要经输血等非肠道途径传播 ，也可存在母-婴传播和医源性传播等 。 HGV单独感染时临床症状不明显 ，一般不损害肝脏 。 临床表现为： 1、 急性肝炎ALT升高 ， 黄疸比急性丙肝轻 ， 多数很快恢复可与乙 ， 丙肝病毒合并感染 。 2、病毒持续存在病毒始终处于低滴度状态 ，少数高滴变 ，但常无临床症状 。 3 、病情迁延随着病毒滴度因此快速灵敏诊断庚型肝炎病毒具有重要意义 。本产品就是以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测庚型肝炎病毒的试剂盒 ， 它具有下列特点：

1.    即开即用 ，用户只需要提供样品RNA模板。

2.    引物和探针经过优化 ，分析灵敏度高 ，可以达到100拷贝/反应。

3.    提供阳性对照 ，便于区分假阴性样品。

4.   特异性高 ， 引物是根据庚型肝炎病毒RNA高度保守区设计 ，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。

5.    既可用于定性检测 ，又可用于定量检测 。 用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。

6.    本产品足够50次20μL体系的探针法qRT-PCR反应。

7.    本产品只能用于科研。

规格及成分

试剂盒组成

成分

规格

包装

探针法qRT-PCR缓冲液

500μL

0.5 mL

探针法qRT-PCR酶混合液v2

50μL

0.5 mL

荧光PCR专用模板稀释液

1 mL

1.5 mL管

庚型肝炎病毒qRT-PCR引物-探针干粉

50次

1.5 mL

庚型肝炎病毒qRT-PCR阳性对照(1E 7拷贝/μL)

50μL

0.5 mL

注意 ： 引物-探针干粉在使用前需要短暂离心 ，然后在离心管中加入165uL的超纯水充分混匀后再使用 ，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存

低温运输 ， -20℃保存 ，保存期限为12个月。

自备试剂

样品RNA

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以1E 1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例） 。

由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ， 千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分 。 为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ，本产品不提供活体样品做阳性对照 ，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管 ，分别为6 ， 5 ，4 ， 3 ，2 ， 1。

2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液 ，最好用带芯枪头 ， 下同。

3. 在6号管中加入5μL 1 E7拷贝/μL  的阳性对照(试剂盒提供) ，充分震荡1分钟 ，得1E6拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。

4.   换枪头 ， 在5号管中加入5μL 1 E6拷贝/μL  的阳性对照(上步稀释所得) ， 充分震荡1分钟 ，得1E 5拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。

5. 换枪头 ， 在4号管中加入5μL 1 E 5拷贝/μL  的阳性对照(上步稀释所得) ， 充分震荡1分钟 ，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如 果 有 N 个 样 品  ， 最 好 设 置 N+2 个 提 取  ， 多 出 的 一 个 是 PC （样 品 制 备 阳 性 对照）  ， 一个是NC（样品制备阴性对照）  。 可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样  ， 以此作为PC 。另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的DNA  ，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容 。

也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、 Probe qPCR反应（20μL体系 ，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复 ， 则标记N+9个PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品  ，  1个用于PCR阴性对照 （用水做模板）  ， 6个用于标准曲线 。 如果做定性分析并且只做1次重复 ，则标记N+4个RT-PCR管 ，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品  ，  1个用于RT-PCR阴性对照 （用水做模板）  ，  1个用于RT-PCR阳性对照 （直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）  。 下面只以定量分析

为例描述操作步骤。

10.  在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复 。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照 ， 并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加） :

11. 盖上盖子后上机 ，按下面参数进行PCR：

注 ：部分（如 ：伯乐CFX96） 机型如果两步法效果不理想可采用三步法： 50℃  10分钟（逆转录） ，95℃  3分钟 ，（95℃   15秒、 58℃  30秒、 72℃  30秒） 循环40次 ，每个循环第三步采集荧光信号。

四、数据处理

12. 如果样本制备阳性对照或PCR阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性 ， 则整个实验无效 ，不需要分析数据 ， 需要重新样本制备 ， 重新进行PCR扩增或跟厂家联系 。 如果样本制备阴性对照或PCR阴性对照结果为阳性 ， 说明环境污染 ， 则整个实验无效 ，不需要分析数据 ，需要跟厂家联系。

13. 如果阴性对照和阳性对照均正常 ，则实验有效 ，可以进入后续分析。

14. 如果把本试剂盒用于定量检测 ， 则以阳性对照浓度的log值为横轴 ， 以Ct值为纵轴 ,