钩端螺旋体通用探针法 qPCR 试剂盒Leptospira spp. Probe PCR Kit

产品及特点

钩 端 螺 旋 体 通 用 （Leptospira  spp . ） 简 称 钩 体 ， 至 少 有 20 个 种 ， 其 中 致 病性的 有9 种 、 中等致 病性5 种 、 腐生性 的6 种 。 致病性 钩体 能引起 人及动 物的 钩端螺旋体病 ， 简称钩 体病 ， 是在世界各地都广泛 流行的一种人畜共患病 ， 鼠 类和猪是两大主要传染源 。 其流行几乎遍及全世界 ， 中 国绝大多数地区都有不同程 度的流行 ，尤以南方各省最 为严重 ， 对人民健康危害很 大 ， 是中国重点防治的传染 病之 一 ， 因此快速检测钩端螺旋体具有重要的意义 。 本产品就是以探针法荧光定量PCR 技术为基础开发的专门检测钩端螺旋体通用的试剂盒 ， 它具有下列特点 ：

1.  即开即用 ， 用户只需要提供样品DNA 模板。

2.  引物和探针经过优化 ， 分析灵敏度高 ， 可以达到100 拷贝/反应。

3. 提供阳性对照 ， 便于区分假阴性结果。

4. 特 异 性 高 ， 引 物 是 根 据 钩 端 螺 旋 体 通 用 DNA 高 度 保 守 区 设 计 ， 不 会 跟 其 他 生 物的DNA 发生交叉反应。

5.  In  s ili co 分 析 发 现 本 产 品 可 以 检 测 到 已 知 的 所 有 9 种 致 病 性 钩 端 螺 旋 体 ： L. i nter rog a ns 、  L.   ki r sc h ner i 、  L.   noguc hi i  、  L.   borg petersen ii  、  L. we il ii  、 L.  santa rosa i 、 L.  alexander i 、 L.  alston ii和L.  k mety i 。

6.  既 可 用 于 定 性 检 测 ， 又 可 用 于 定 量 检 测 。 定 量 检 测 时 线 性 范 围 至 少 为 5 个 数 量级。

7. 本产品足够50 次20μL体系的探针法荧光定量PCR 反应。

8. 本产品只能用于科研。

规格及成分

试剂盒组成

成分

规格

2 × Probe qPCR MasterMix

0.5 mL

荧光PCR模板专用稀释液

1 mL

超纯水

1 mL

钩端螺旋体通用qPCR引物-探针干粉

150μL

钩端螺旋体通用qPCR阳性

对照(1E 7拷贝/μL)

50μL

注意： 引物-探针干粉在使用前需要短暂离心 ，然后在离心管中加入165μL的超纯水充分混匀后得到引物-探针混合液再使用 ，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存

低温运输 ， -20℃保存 ，保存期限为24个月。

自备试剂

样品 DNA

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以1E 1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例） 。

由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ， 千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分 。 为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ， 本产品不提供活体样品做阳性对照 ，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管 ，分别为6 ， 5 ，4 ， 3 ，2 ， 1。

2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液 ，最好用带芯枪头 ，下同 。

3. 在6号管中加入5 μL 1E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供) ，充分震荡1分钟 ，得1E6拷贝/μ L的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头 ，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟，得1E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头 ，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品 ， 最好设置N+2个提取 ， 多出的一个是PC （样品制备阳性对照） ，一个是NC （样品制备阴性对照） 。 可以用10 μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样 ， 以此作为PC 。 另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的DNA ， 本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、 Probe qPCR反应（20μL体系 ，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复 ， 则标记N+9个PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于PCR阴性对照 （用水做模板） ， 6个用于标准曲线 。 如果做定性分析并且只做1次重复 ， 则标记N+4个PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于PCR阴性对照（用水做模板） ， 1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板） 。 下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分 （本表只列出一次重复 。 样品管和阴性对照设置完毕