呼吸道合胞病毒探针法 qRT-PCR 试剂盒 Respiratory Syncytial Virus Probe qRT-PCR Kit

产品及特点

呼吸道合胞病毒 （ Respiratory Syncytial Virus,  RSV） 属于副黏病毒科的肺病毒属（ Pneumovirus） ，病毒形态为球形 ， 直径为  120 ~300nm ， 有包膜 ，基因组为非分节段的单负链 RNA ，编码  10 种蛋白质 ，只有一种血清型  ， 主要引起 6 个月以下婴儿患细支气管炎和肺炎等下呼吸道感染 ， 以及较大儿童和成人的鼻炎、 感冒等上呼吸道感染 。 因此快捷灵敏地对其诊断具有重要意义 。本产品就是以探针法荧光定量  RT-PCR技术为基础开发的专门检测呼吸道合胞病毒的试剂盒 ， 它具有下列特点：

1.    即开即用 ，用户只需要提供样品  RNA  模板。

2.    引物和探针经过优化 ，灵敏性高 ，可以达到  100 拷贝/反应。

3.    提供阳性对照 ，便于区分假阴性样品。

4.   特异性高 ， 引物是根据呼吸道合胞病毒的高度保守区设计 ，不会跟其他病毒RNA 发生交叉反应。

5.    既可以用于定性 ，又可用于定量。用于定量时其线性范围不少于五个数量级。

6.   本产品足够   50  次   20μL  体系的探针法荧光定量   RT-PCR  反应。

7.    本产品只能用于科研。

规格及成分

试剂盒组成

注意 ： 引物-探针干粉在使用前需要短暂离心 ，然后在离心管中加入165uL的超纯水充分混匀后再使用 ，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存

低温运输 ， -20℃保存 ，保存期限为12个月。

自备试剂

样品RNA

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以 10E 1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例） 。

由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ， 千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分 。 为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ，本产品不提供活体样品做阳性对照 ，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管 ，分别为6 ， 5 ，4 ， 3 ，2 ， 1。

2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液 ，最好用带芯枪头 ， 下同。

3. 在 6 号管中加入5μL 1 × 10E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供) ，充分震荡1分钟 ，得1 × 10E6拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。

4. 换枪头 ，在 5 号管中加入5μL 1 × 10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟 ，得1 × 10E 5拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。

5. 换枪头 ， 在4号管中加入5μL 1 × 10E 5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟 ，得1 × 10E4拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如 果 有 N 个 样 品  ， 最 好 设 置 N+2 个 提 取  ， 多 出 的 一 个 是 PC （样 品 制 备 阳 性 对照）  ， 一个是NC（样品制备阴性对照）  。 可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样  ， 以此作为PC 。另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的DNA  ，本试剂盒跟市场上大多数样品RNA提取试剂盒兼容 。

也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、 Probe qPCR反应（20μL体系 ，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复 ， 则标记N+9个RT-PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品  ， 1个用于RT-PCR阴性对照 （用水做模板）  ， 6个用于标准曲线 。 如果做定性分析并且只做1次重复 ， 则标记N+4个RT-PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板）  ， 1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）  。 下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.  在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复 。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照 ， 并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加） :