鸽圆环病毒探针法 qPCR 试剂盒 Pigeon circovirus Probe qPCR Kit

产品及特点

鸽圆环病毒（Pigeon circovirus）属于圆环病毒科，是单股 DNA 病毒，鸽圆环病毒感染一般临床症状表现为精神委顿，呼吸困难， 缩颈，食欲减退，消瘦，体重减轻，腹泻。其临床特征性症状是贫血，眼砂变淡，喙、口咽黏膜颜色由红急骤转为苍白。有时也会出现翅膀、尾、羽毛渐进性营养不良、大量脱落和喙变形，这些也是本病的典型特征。因此快速检测鸽圆环病毒具有重要的意义。本产品就是以探针法 qPCR 技术为基础开发的专门检测鸽圆环病毒的试剂盒，它具有下列特点：

1.   即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2.   引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。

3.   提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.   特异性高，引物是根据鸽圆环病毒 DNA 高度保守区设计，不会跟其他生物的 DNA 发生交叉反应。

5.   既可用于定性检测，又可用于定量检测。定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。

6.   本产品足够50次20μL体系的探针法qPCR反应。

7.   本产品只能用于科研。

规格及成分

试剂盒组成

注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存

低温运输 ，-20℃保存 ，保存期限为24个月。

自备试剂

样品DNA

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6 拷贝/μL拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。

2. 用带芯枪头分别加入45μL 荧光PCR专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

3.  在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照（试剂盒提供），充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6 拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5 拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4 拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 μL 上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qPCR 反应（20μL体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4 个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无 Ct或 Ct 大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于 40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct 或 Ct 大于或等于 40，则为阴性。如果 Ct 小于 40 则为阳性。

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