牛呼吸道合胞体病毒探针法qRT-PCR试剂盒（不含内参） Bovine Respiartory Syncytial Virus Probe qRT-PCR Kit

产品及特点

牛 呼 吸 道 合 胞 体 病 毒 (Bovine  Respiartory  Syncytial  Virus ， BRSV)为 多型性 的RNA 病毒 ， 基 因组为 单链 负义 RNA ， 长 约15.2  k nt 。 对 热敏 感 ， 加 热56 ℃ 10 分钟均死亡 。 对酸敏感 ， 保存的最佳pH 值为7 .5 。 牛呼吸道合胞体病毒感染上呼吸道时表 现为咳嗽 ， 鼻及 眼有分泌物 ， 严 重感染时 ， 病畜 表现为厌食 、 精 神不振 、体温上升 、 呼吸急迫 、 泌 乳牛产奶量下降 、 咳嗽 、 流鼻液 、 流泪 、 流口水 等 。 该病已波及加拿大 、 美国 、 匈牙利 ,丹麦 、 荷兰 、 澳大利亚 、 挪威 、 苏丹 、 意大利 ， 法国等 ， 15-18 月 龄 的 牛 中 有 80-100 ％ 发 病 , 死 亡 率 为1 -3％ 。 牛 呼 吸 道 合 胞 体 病 毒 养牛业造成 了巨大的经济损 害 ， 因此快速检 测牛呼吸道合胞 体病毒具有重要 的意义 。为 此 ， 本 公 司 以 探 针 法 q RT-PCR 技 术 为 基 础 开 发 了 牛 呼 吸 道 合 胞 体 病 毒 的 检 测 试剂盒 ， 它具有下列特点 ：

1.    即开即用 ，用户只需要提供样品  RNA  模板。

2.    引物和探针经过优化 ，灵敏性高 ，可以达到  100 拷贝/反应。

3.    提供阳性对照 ，便于区分假阴性样品。

4.   特异性高 ， 引物是根据牛呼吸道合胞体病毒RNA高度保守区设计 ，不会跟其他生物的 RNA发生交叉反应。

5.    既可用于定性检测 ，又可用于定量检测 。 用于定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。

6.   本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量qRT-PCR反应。

7.   本产品只能用于科研。

规格及成分

试剂盒组成

注意： 引物-探针干粉在使用前需要短暂离心 ，然后在离心管中加入165 μL的超纯水充分混匀后再使用 ，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存

低温运输 ， -20℃保存 ，保存期限为12个月。

自备试剂

样品RNA ，超纯水 ，核酸纯化试剂盒

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以1E 1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例） 。

由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ， 千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分 。 为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ，本产品不提供活体样品做阳性对照 ，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管 ，分别为6 ， 5 ，4 ， 3 ，2 ， 1。

2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液 ，最好用带芯枪头 ，下同 。

3. 在6号管中加入5 μL 1E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供) ，充分震荡1分钟 ，得1E6拷贝/μ L的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头 ，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟 ，得1E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头 ，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品 ， 最好设置N+2个提取 ， 多出的一个是PC （样品制备阳性对照） ，一个是NC （样品制备阴性对照） 。 可以用10 μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样 ， 以此作为PC 。另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的RNA  ， 本试剂盒跟市场上大多数样品RNA提取试剂盒兼容。

也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、 Probe qPCR反应（20μL体系 ，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复 ， 则标记N+9个RT-PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品  ， 1个用于RT-PCR阴性对照 （用水做模板）  ， 6个用于标准曲线 。 如果做定性分析并且只做1次重复 ， 则标记N+4个RT-PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板）  ， 1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）  。 下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.  在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复 。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照 ， 并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加） :