人偏肺病毒探针法qRT-PCR试剂盒（不含内参） Human Metapneumo Virus Probe qRT-PCR Kit

产品及特点

人偏肺病毒(Human Metapneumo Virus ， h MPV) ， 是一种新近被发现的呼吸道致病 RNA 病毒 。 其感染多集中于冬春两季 ， 各年龄段人群皆有感染风险 ， 其中儿童 、老年人以及免疫缺陷患者更是易感高危群体 。 全球各国所报道的该病毒感染率差异较大 ， 感染后的症状表现各异 ， 轻则仅出现上呼吸道的轻微病变 ， 重则会引发严重的细支气管炎甚至肺炎 。 该病毒严重危害了人类的生命健康 ， 因此快速检测人偏肺病毒具有重要的意义 。 为此 ， 本公司以探针法qRT-PCR技术为基础开发了人偏肺病毒的检测试剂盒 ， 它具有下列特点：

1.   即开即用 ，用户只需要提供样品 RNA 模板。

2.    引物和探针经过优化 ，灵敏性高 ，可以达到 100 拷贝/反应。

3.   提供阳性对照 ，便于区分假阴性样品。

4.   特异性高 ， 引物是根据人偏肺病毒RNA高度保守区设计 ，不会跟其它RNA发生交叉反应。

5.    既用于定性检测 ，又用于定量检测 。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6.   本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 qRT-PCR 反应。

7.   本产品只能用于科研。

规格及成分

试剂盒组成

注意： 引物-探针干粉在使用前需要短暂离心 ， 然后在离心管中加入165uL的超纯水充分混匀后再使用 ，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存

低温运输 ， -20℃保存 ，保存期限为12个月。

自备试剂

样品RNA ，超纯水 ，核酸纯化试剂盒

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以1E 1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例） 。

由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ， 千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分 。 为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ，本产品不提供活体样品做阳性对照 ，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管 ，分别为6 ， 5 ，4 ， 3 ， 2 ， 1。

2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液 ，最好用带芯枪头 ， 下同 。

3. 在6号管中加入5 μL 1 E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供) ， 充分震荡1分钟 ， 得1E6拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。

4. 换枪头 ， 在5号管中加入5 μL 1 E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟 ，得1E 5拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。

5. 换枪头 ， 在4号管中加入5 μL 1 E 5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1分钟 ，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品 。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品 ， 最好设置N+2个提取 ， 多出的一个是PC （样品制备阳性对照） ，一个是NC （样品制备阴性对照） 。 可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样 ， 以此作为PC 。另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的RNA  ， 本试剂盒跟市场上大多数样品RNA提取试剂盒兼容。

也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、 Probe qRT-PCR反应（20μL体系 ，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复 ， 则标记N+9个RT-PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品  ， 1个用于RT-PCR阴性对照 （用水做模板）  ， 6个用于标准曲线 。 如果做定性分析并且只做1次重复 ， 则标记N+4个RT-PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板）  ， 1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）  。 下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.  在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复 。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照 ， 并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加） :

成分

样品管N+2个

PCR阴性对照

标准曲线样品管

（1-6管）

探针法qRT-PCR缓冲液

10μL

10μL

各10μL