葡萄金黄化植原体探针法qPCR试剂盒（不含内参） Grapevine flavescence dorée phytoplasma Probe qPCR Kit

产品及特点

葡 萄 金 黄 化 植 原 体(Grapevine  flav esc en ce  d or é e  phytoplasma)是 一 种专性细胞内寄生 菌 ， 它们寄生在植物的筛管 韧皮部 ， 并能在其昆虫传播 媒介的多个组织和血淋巴中 繁殖 ， 主要影响欧洲的葡萄 园 。 感染葡萄金黄化植原体 的葡萄植株可能会出现叶片 变黄 、 向下卷曲 、 脆化和早 落 ， 枝条矮化和不木栓化 、 顶芽和侧芽坏死 、 果实产量 下降等症状 。 这种病原体的 传播对葡萄产量造成重大损 失 。 同时 ，因葡萄含糖量降 低和酸度升高 ， 进而影响葡 萄酒的生产 。 葡萄金黄化植 原体对葡萄种植业造成严重 的经济损失 。 因此快速检测 葡萄金黄化植原体具有重要 的意义 。 为此 ， 本 公 司 以 探 针 法q PCR 技 术 为 基 础 开 发 了 葡 萄 金黄 化 植 原 体 的 检 测 试 剂 盒 ， 它具有下列特点 ：

1.  即开即用 ， 用户只需要提供样品DNA 模板。

2.  引物和探针经过优化 ， 分析灵敏度高 ， 可以达到100 拷贝/反应。

3. 提供阳性对照 ， 便于区分假阴性结果。

4. 特 异 性 高 ， 引 物 是 根 据 葡 萄 金 黄 化 植 原 体 DNA 高 度 保 守 区 设 计 ， 不 会 跟 其 他 生物的DNA 发生交叉反应。

5.  既 可 用 于 定 性 检 测 ， 又 可 用 于 定 量 检 测 。 定 量 检 测 时 线 性 范 围 至 少 为 5 个 数 量级。

6. 本产品足够50 次20μL体系的探针法荧光定量q PCR 反应。

7. 本产品只能用于科研。

规格及成分

试剂盒组成

成分

规格

2 × Probe qPCR MasterMix

0.5 mL

荧光PCR专用模板稀释液

1 mL

超纯水

1 mL

葡萄金黄化植原体

qPCR引物-探针干粉

50次

葡萄金黄化植原体qPCR阳性对照(1E 7拷贝/μL)

50μL

注意： 引物-探针干粉在使用前需要短暂离心 ，然后在离心管中加入165 μL的超纯水充分混匀后得到引物-探针混合液再使用 ，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存

低温运输 ， -20℃保存 ，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA ，超纯水 ，核酸纯化试剂盒

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以 1 E 1 -1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例） 。

由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ， 千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分 。 为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ， 本产品不提供活体样品做阳性对照 ，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管 ，分别为6 ， 5 ，4 ， 3 ，2 ， 1。

2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液 ，最好用带芯枪头 ，下同 。

3. 在 6 号管中加入 5 μL 1E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供) ，充分震荡 1 分钟 ，得 1E6拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头 ，在 5 号管中加入 5 μL 1E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡 1 分钟 ，得 1E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头 ，在 4 号管中加入 5 μL 1E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡 1 分钟 ，得 1E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品 ， 最好设置N+2个提取 ， 多出的一个是PC （样品制备阳性对照） ，一个是NC （样品制备阴性对照） 。 可以用10μL上述所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样 ， 以此作为PC 。 另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的DNA ， 本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、 Probe qPCR反应（20μL体系 ，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复 ， 则标记N+9个PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于PCR阴性对照 （用水做模板） ， 6个用于标准曲线 。 如果做定性分析并且只做1次重复 ， 则标记N+4个PCR管 ， 其中N+2个用于上步得到的N+2个样品 ， 1个用于PCR阴性对照（用水做模板） ， 1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板） 。 下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分 （本表只列出一次重复 。 样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照 ， 并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加） :