人免疫缺陷病毒 I 型探针法 qRT-PCR 试剂盒 Human Immunodeficiency Virus 1 Probe qRT-PCR Kit

产品及特点

人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）是引起艾滋病的病原体，属于逆转录病毒科慢病毒亚科，为单股正链 RNA 病毒，基因组约为 9.7 kb。人免疫缺陷病毒主要分人免疫缺陷病毒 I 型和人免疫缺陷病毒 II 型两种亚型，人免疫缺陷病毒 I 型在全世界流行，是严重危害人类身体健康和生命的病毒性传染病的病原体，也是全球社会主要的公共卫生问题。因此快速检测人免疫缺陷病毒 I 型病毒具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测人免疫缺陷病毒 I 型的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到100拷贝/反应。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据人免疫缺陷病毒 I 型 RNA 高度保守区设计，不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。

5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6. 本产品足够 50 次 20 μL 体系的探针法荧光定量 qRT-PCR 反应。

7. 本产品只能用于科研。

规格及成分

试剂盒组成

注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入165μL的超纯水充分

混匀后得到引物-探针混合液再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存

低温运输 ，-20℃保存 ，保存期限为12个月。

自备试剂

样品RNA、超纯水

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以1E1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例） 。

由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分 。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ，本产品不提供活体样品做阳性对照 ，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管 ，分别为6 ，5 ，4 ，3 ，2 ， 1。

2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光RT-PCR专用模板稀释液 ，最好用带芯枪头 ，下同 。

3. 在6号管中加入5 μL 1E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品 ，最好设置N+2个提取 ，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC 。另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qPCR反应（20μL体系 ，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线 。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）:

11. 盖上盖子后上机 ，按下面参数进行RT-PCR：

注：部分（如：伯乐 CFX96）机型如果两步法效果不理想可采用三步法：50℃ 10 分钟，95℃ 4 分钟，（94℃ 15 秒、56℃ 15 秒、72℃ 30 秒）循环 35-45 次，每个循环第三步采集荧光信号。

四、数据处理

12. 如果样本制备阳性对照或 PCR 阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行 PCR 扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或 PCR 阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。

13. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。

14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须没有 Ct 值，或者 Ct 等于或者大于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 40。对待测样品，如果其 Ct 小于 40 则为阳性。如果没有 Ct 值，或者大于或等于 40 则为阴性。

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